OptoRheo: 동시 현장 마이크로

커뮤니케이션 생물학 6권, 기사 번호: 463(2023) 이 기사 인용

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측정항목 세부정보

세포외 기질(ECM)의 생체역학적 신호는 정상적인 발달 및 복구부터 질병 진행에 이르기까지 많은 세포 과정을 지시하는 데 필수적입니다. 세포-기질 상호 작용을 더 잘 이해하기 위해 우리는 광시트 형광 현미경과 입자 추적 미세유변학을 결합한 'OptoRheo'라는 새로운 장비를 개발했습니다. OptoRheo를 사용하면 며칠에 걸쳐 증식하는 세포를 3D로 이미지화하는 동시에 세포 이하 길이 규모에서 주변 세포외 및 세포주위 기질의 기계적 특성을 감지할 수 있습니다. OptoRheo는 두 가지 작동 방식(광학 트랩 유무)으로 사용하여 미세유변학 측정의 동적 범위를 확장할 수 있습니다. 우리는 두 개의 서로 다른 배양 시스템, 3D 하이드로겔의 세포 클러스터 및 현탁 배양의 회전 타원체에서 살아있는 유방암 세포를 둘러싼 ECM을 특성화하여 이를 확증했습니다. 이 최첨단 장비는 복잡한 세포 배양 매트릭스를 통해 약물 전달 탐색을 변화시키고 차세대 질병 모델의 설계를 최적화합니다.

세포는 견인력을 사용하여 강성을 조사하고 이동을 조종하며 세포의 운명에 영향을 미쳐 세포 길이 규모에서 세포외 기질(ECM)의 기계적 특성을 감지하고 반응합니다. 동시에, ECM은 세포 이동 및 형태학적 재배열 동안 이러한 견인력을 발휘하기 때문에 세포에 의해 지속적으로 리모델링됩니다. ECM의 기계적 특성 이상은 암7 및 섬유증8과 같은 병리학의 발달에 결정적인 역할을 하며, 종종 치료 개입에 대한 장벽을 설정합니다9. 건강과 질병에서 경험되는 광범위한 기계적 환경을 고려할 때 ECM 생체 역학에 대한 세포 영향을 모델링하고 이해하는 것은 어렵습니다. 건강한 조직에서 탄성률은 수십 Pa(예: 뇌, 폐)에서 10KPa(예: 골격근, 뼈)까지 다양하며, 암 및 섬유증과 같은 질병 상태에서는 강직도에 눈에 띄는 변화가 나타납니다. 예를 들어 정상 유방의 경우 800Pa에서 유방암의 경우 4KPa 이상)10. 더욱이, ECM의 완전한 기계적 특성화에는 세포 행동에 영향을 줄 수 있는 점성 성분도 포함되어 있습니다. 조정 가능한 기계적 특성을 가진 공학적 하이드로겔의 최근 개발로 인해 시험관 내에서 ECM 마이크로 아키텍처의 요소를 재현하고 세포 프로세스에 대한 ECM 점탄성의 영향을 밝힐 수 있게 되었습니다. 이러한 발전과 그 중요성에도 불구하고 세포-기질 상호작용의 기계적 과정은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다. 예를 들어, 셀은 마이그레이션하기 전에 로컬 환경을 '프라이밍'합니까, 아니면 ECM의 기존 약점을 이용하여 그에 따라 마이그레이션합니까? 이러한 답이 없는 질문에는 ECM의 미세한 기계적 특성의 변화를 현장에서 실시간으로 며칠 동안 국소적으로 증식하는 세포에 모니터링하기 위한 최소 침습적 광학 접근 방식이 필요합니다.

이 목표를 해결하기 위해 OptoRheo는 세 가지 다른 현미경 기술, 광시트 현미경, 다중면 현미경 및 광학 트래핑을 단일 장비에 결합합니다. 이 접근 방식을 사용하면 3D 세포 배양 깊숙한 곳에서 실시간 형광 이미징이 가능하고, 세포에 국한되거나 멀리 있는 동일한 관심 영역 내에서 ECM의 미세유변학 측정이 가능합니다. 3D 형광 이미징은 상업용 역현미경 본체에 구축된 새로운 버전의 반사광 시트 형광 현미경(LSFM)16,17,18,19을 사용하여 커버슬립에서 수백 마이크론 깊이의 이미지를 실시간 3D 세포 배양 내에서 이미지화하고 하위 - 세포 해상도. 샘플은 z-스캐닝 중에 렌즈 담금으로 인한 교란이나 오염 위험 없이 완전히 정지 상태로 유지됩니다. 두 가지 모두 관찰이 샘플의 기계적 또는 생물학적 특성에 영향을 미치지 않도록 하는 데 중요합니다. 이 구성을 사용하면 하이드로겔 지지체와 같은 섬세한 샘플을 기성품 챔버 커버슬립에서 간단히 이미지화할 수 있습니다. ECM의 점탄성 특성을 추출하기 위해 OptoRheo는 넓은 시간 범위에 걸쳐 유변학적 프로브 역할을 하는 미크론 크기 비드의 열 구동 브라운 운동을 추적합니다. 불활성 비드 프로브는 캡슐화6,20,21,22 동안 하이드로겔에 내장되거나 세포 내 점탄성을 조사하기 위해 세포 내로 내부화될 수도 있습니다. 현탁 배양에서는 광학 트랩을 사용하여 계측기가 특성화할 수 있는 재료의 범위를 확장하는 동안 세포의 마이크로니치 내 시야에 프로브를 고정할 수 있습니다24. 마지막으로 OptoRheo는 OptiMuM25용으로 개발된 것과 유사한 구성으로 미세유변학을 3D로 확장하여 세포외 미세환경의 완전한 3D 특성화를 달성하는 데 사용할 수 있는 선택적 다중면 이미징을 통합합니다.

\, {G}^{{\prime}{\prime}}(\omega )\)) at low frequencies transitioning to a high frequency glassy state (Figs. 3e, 5a). Environmental control on OptoRheo allowed the gel samples to be kept under physiological conditions over multiple days, making it possible to re-visit selected microsphere probes multiple times over the duration of the experiment (three days) to follow the changing ECM properties over time. This was performed in triplicate./p>50 μm) (Fig. 5f) hinting at a gel remodelling front./p>